【佳學基因檢測】基因檢測技術(shù)有哪些？焦磷酸測序

核心原理是基于檢測DNA合成過程中釋放的焦磷酸，從而鑒別是否有特定核苷酸整合到DNA的合成鏈中而發(fā)展的測序技術(shù)，因此該測序技術(shù)亦稱焦磷酸測序技術(shù)。

測序。將熒光標記的dNTP、聚合酶、引物加入到測序通道啟動測序循環(huán)。DNA合成時，伴隨著堿基的加入會有焦磷酸被釋放，從而發(fā)出熒光，不同堿基用不同熒光標記，讀取到核苷酸發(fā)出的熒光后，將3羥基末端切割，隨后加入第2個核苷酸，重復先進個核苷酸的步驟，直到模板序列全部被合成雙鏈DNA。

焦磷酸測序能夠快速的檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性和定量檢測。通過正確定量單個連續(xù)的CpG位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序本身能檢測并定量甲基化水平上的改變。

將經(jīng)過預處理之后的微珠放于帶有直徑約為44um的小孔的PTP平板上，平板上的每個小孔僅能容納一個微珠，將微珠固定在小孔里。測序反應以微珠上的DNA位模板每次反應加入一種dNTP，當配對成功時，會釋放焦磷酸基團。焦磷酸基團會與反應體系中的酶（ATP硫酸化學酶）反應生成ATP，并和熒光素酶共同氧化熒光素從而發(fā)出熒光。每種dNTP產(chǎn)生的熒光顏色不同，記錄熒光信息并分析后即可得到測序結(jié)果。反應結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導致熒光淬滅，以便使測序反應進入下一個循環(huán)。

科技簡介

焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)是一種新的酶聯(lián)水平聯(lián)測序技術(shù)，它適用于已知的短序列測序分析，其重復性、正確性與SangerDNA測序法相當，但速度有很大提高。通過測定焦磷酸序列，可以同時分析大量樣品，為高效、低成本、快速、正確地檢測DNA甲基化、SNP等單個或連續(xù)多種核苷酸變異提供了理想的技術(shù)平臺。由于它能快速檢測甲基化的頻率，所以可以對樣品中的甲基化位點進行定性和定量分析，是甲基化檢測的金標準。

科技優(yōu)勢

1.獲得定量序列結(jié)果的少有技術(shù)。

2.極其正確。

3.功能多樣，適用范圍極廣。

4.靈活的試驗設計。

技術(shù)性比較

工藝原理

用四種酶催化的焦磷酸測序技術(shù)是同一種反應體系中的酶級聯(lián)反應，其原理是：引物在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4個酶的協(xié)同作用下，引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，實現(xiàn)對DNA序列的實時測定。

試驗程序

排序的原則。

科技應用成果展示

1、甲基化檢測。

灰白區(qū)：甲基化率；黃色區(qū)域：重硫酸鹽處理程度。

2、SNP檢測。

3、檢測點突變。

該技術(shù)進行改進后可以滿足上百個核苷酸序列的測序工作，這樣該技術(shù)又可以滿足對重要微生物的鑒定與分型，特定DNA片段的突變檢測和克隆鑒定等方面的應用。

原理

焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應。焦磷酸測序技術(shù)的原理是：引物與模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。

焦磷酸測序技術(shù)的反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構(gòu)成。反應底物為5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、熒光素(1uciferin)。反應過程在每一輪測序反應中，反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP,在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上述反應不會發(fā)生，也就沒有檢測峰。反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應完成后，加入另一種dNTP，使上述反應重復進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取正確的DNA序列信息。

應用焦磷酸測序技術(shù)可以用來研究單核苷酸多態(tài)性(single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遺傳多態(tài)性，植物多態(tài)性分析，分子診斷細菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學等方面都有廣泛的應用。該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。與Sanger測序法相比，焦磷酸測序技術(shù)有其特定的優(yōu)勢，已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。目前已經(jīng)有很多關(guān)于該技術(shù)在分子生物學上的應用研究，而且隨著技術(shù)的不斷成熟和改進，在實踐中的應用將越來越廣泛。Jonasson等運用焦磷酸測序技術(shù)通過檢測病原菌16S rRNA基因，快速鑒定臨床標本中抗生素抵抗菌;Monstein等用焦磷酸測序技術(shù)檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因(16S rDNA)易變的Vl和V3區(qū)序列，證明該技術(shù)可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型;Unnerstad等利用該技術(shù)對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，在短時間內(nèi)完成大量的樣本測序，其并行性和高效率非常顯著，如果用常規(guī)的測序技術(shù)，工作量會很大。Gharizadeh等人用此技術(shù)對67個人乳頭瘤病毒(HPV)樣品進行了鑒定和分型，結(jié)果證明該技術(shù)也非常適于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。瑞典Uppsala大學利用焦磷酸測序技術(shù)建立了新的鑒定炭疽熱細菌(Bacillus anlhracis)及其致病狀態(tài)的方法，他們利用此技術(shù)分析染色體上的Ba813基因(此基因長度為277bp，在染色體上為單拷貝是炭疽熱桿菌區(qū)別于其他土壤桿菌的標志)20bp的特異序列來鑒定炭疽熱細菌.正確率達99.6 %，通過分析菌株是否含有兩個質(zhì)粒(鑒定pX0l的lef基因和pX02的cap基因)來確定炭疽熱細菌的致病狀態(tài).正確率達100‰。Edvinsson B等應用焦磷酸測序技術(shù)對T弓形體蟲的三個亞型進行區(qū)分，采用Real-Time PCR技術(shù)擴增出目的片段，在此基礎(chǔ)上運用焦磷酸測序技術(shù)測定GRA6基因中兩個單核甘酸多態(tài)性確定其分型,該技術(shù)對典型蟲株的正確率達到100%,對包括非典型性蟲株的分型正確率也達到81%。該技術(shù)還被應用于百日咳桿菌(Bordetella pertussis)與副百日咳桿菌(Parapertussis) 等細菌的快速鑒定及分型。

在國內(nèi)，該技術(shù)應用受到越來越多研究者的重視。趙錦榮等，首先運用PCR擴增含耐藥決定區(qū)一297bp長的rpoB基因片段，借用鏈親和素包被磁珠純化單鏈PCR產(chǎn)物，設計2個正向測序引物，運用pyrosequencing技術(shù)對耐藥決定區(qū)進行序列測定.通過對一系列10倍稀釋的結(jié)核分枝桿菌H，R標準株DNA進行分析，評價所建立方法的檢測特異性.結(jié)果：PCR擴增后，可在2 h內(nèi)得到耐藥決定區(qū)序列.所建立方法的檢測靈敏度為50 fg DNA/反應.在所分析的利福平敏感株中均未檢測到耐藥決定區(qū)突變，而在耐利福平菌株中均檢測到耐藥決定區(qū)突變.所建立的方法具有自動化程度高和結(jié)果正確等特點，適用于對耐利福平結(jié)核分枝桿菌進行快速高通量檢測。

程紹輝等，從感染人sars病毒的Vero-6細胞中提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴增目的基因片段，采用焦磷酸測序技術(shù)(Pyro- sequencing Technology，PSQ)進行第2601、7919、9479、119838多個堿基突變位點測序和突變頻率分析。通過測序分析多個可能出現(xiàn)突變的位點，確定了該病毒為北京流行株，同時發(fā)現(xiàn)第7919位堿基發(fā)生了A/G突變。

宋家武等應用該技術(shù)建立了高通量測定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法，經(jīng)標準的YMDD突變質(zhì)粒及血清標本的重復性及高效性檢測，質(zhì)粒標準品的突變檢出率及重復率均達100%，而血清標本達98.8%。

另外，在法醫(yī)鑒定，以及SNP分析上都有應用該技術(shù)的研究報道，并且可以起到快速，正確的效果。在動物如豬的多態(tài)性分析研究中，Milan等利用焦磷酸測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌糖原含量增高與PRKAG3基因的一個不可逆轉(zhuǎn)的堿基置換相關(guān)，該基因編碼豬肌肉特異性的腺苷單磷酸激活的蛋白激酶異構(gòu)體的調(diào)節(jié)亞單位。

優(yōu)點

1.不需要制膠，不需要毛細管，也不需要熒光染料和同位素。

2.10分鐘內(nèi)可分析96個樣品的SNP,可滿足高通量分析的要求。

3.每個樣品孔都可進行獨立的測序或SNP分析，實驗設計靈活。

4.序列分析簡單，結(jié)果正確高效。

發(fā)展目前市場上焦磷酸測序儀的測序原理主要有四種，即使用合成法測序（Sequencing by Synthesis）的 454 和Solexa，以及使用連接法測序（Sequencing by Ligation）的SOLiD和Polonator。

以454焦磷酸測序技術(shù)為例，該技術(shù)無需文庫構(gòu)建，沒有克隆誤差，目前已應用到土壤、海洋、廢水等環(huán)境生態(tài)學的研究中。而454焦磷酸測序與傳統(tǒng)測序技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：（1）高通量性：每一次循環(huán)反應，可產(chǎn)生得到大于1Gb的數(shù)據(jù)，讀取10億個堿基；（2）效率高：每一次循環(huán)反應僅需3天；（3）精讀范圍大：可精讀18bp個以上的重復序列；（4）方向多元：可進行400bp長度的末段雙向測序。通過對環(huán)境樣品進行宏基因組提取，對其16S rDNA擴增后，采用454焦磷酸測序技術(shù)對宏基因組樣品進行測序分析，可以清楚的得到環(huán)境樣品的微生物信息。