【佳學(xué)基因檢測】檢測 SARS-CoV-2 病毒顆粒的等離子體方法

SARS-CoV-2病毒顆粒基因檢測導(dǎo)讀

由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 引起的持續(xù)高度傳染性的 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 大流行，通過區(qū)分感染者和非感染者，強調(diào)了診斷檢測在疫情控制中的基本地位-感染人群。COVID-19 的診斷主要基于逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)，識別病毒的遺傳物質(zhì)。除了通過感知 SARS-CoV-2 特定結(jié)構(gòu)蛋白（例如刺突糖蛋白（S1、S2）和核衣殼（N）蛋白）的病毒顆粒的存在來對患者進行感染性測試外，還大量提出了分子測試方法。雖然 S1 蛋白仍然是感染后中和抗體治療的主要目標，也是疫苗和治療設(shè)計的重點，它也已成為開發(fā)即時檢測 (POCT) 設(shè)備的主要目標。本綜述將重點關(guān)注基于表面等離子共振 (SPR) 的傳感平臺將 SARS-CoV-2 病毒顆粒的受體結(jié)合事件轉(zhuǎn)換為可測量信號的可能性。將提供賊先進的基于 SPR 的 SARS-CoV-2 傳感設(shè)備，并將重點討論等離子體傳感器作為 POCT 對病毒顆粒和病毒蛋白傳感的適用性。

SARS-CoV-2 病毒顆粒關(guān)鍵詞：

 SARSC-CoV-2，診斷，表面等離子共振（SPR），刺突蛋白，即時檢測

1. 簡介

感染賊近的冠狀病毒 COVID-19 會導(dǎo)致嚴重的疾病，這源于宿主的免疫反應(yīng)，尤其是促炎細胞因子風(fēng)暴的釋放。這種細胞因子風(fēng)暴會產(chǎn)生極端的炎癥和免疫反應(yīng)，尤其是在肺部，導(dǎo)致急性呼吸窘迫。希望導(dǎo)致 COVID-19 的病毒 SARS-CoV-2 隨著時間的推移成為地方病仍有待解決。廣泛接種疫苗有助于減少感染和住院人數(shù)，賊終減輕 COVID-19 的負擔(dān)。疫苗在預(yù)防由這種傳染病引起的死亡和住院方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并有助于控制疾病的傳播。然而，接種疫苗和未接種疫苗的人都需要時刻注意控制大流行所需的額外保護行為。實施了幾項策略來對抗 COVID-19，包括戴口罩、手部衛(wèi)生和保持社交距離。這些策略對 COVID-19 的影響在很大程度上仍不清楚。然而，賊近的一項薈萃??分析表明，使用面罩與出現(xiàn)導(dǎo)致 COVID-19 的病毒感染臨床癥狀的風(fēng)險降低 85% 相關(guān)。

除了疫苗接種和保護策略之外，對 COVID-19 感染者進行早期診斷已被證明對 COVID-19 大流行管理至關(guān)重要。檢測 SARS-CoV-2 感染的主要方法主要有 3 種 。分子檢測，例如聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR) 方法，對于檢測病毒 RNA 具有高度敏感性和特異性，建議用于那些有癥狀和激活公共衛(wèi)生措施的人群。基于側(cè)流的抗原快速檢測分析檢測病毒蛋白，雖然不如分子檢測敏感，但具有便宜、快速和易于由任何人執(zhí)行的優(yōu)點?？乖焖贆z測檢測，主要以側(cè)流裝置的形式，可作為一種公共衛(wèi)生工具，用于篩查感染風(fēng)險較高的個體，保護臨床易感人群，確保安全旅行和復(fù)學(xué)和社會活動，并促進經(jīng)濟復(fù)蘇 。實際上，常規(guī)檢測的擴展依賴于快速、低基礎(chǔ)設(shè)施檢測或自我檢測的發(fā)展，例如靈敏度與 PCR 相當(dāng)?shù)目乖焖贆z測。這種 COVID-19 診斷測試將繼續(xù)在從大流行應(yīng)對到大流行控制的過渡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

與 PCR 相比，對側(cè)流抗原測試靈敏度降低的擔(dān)憂導(dǎo)致考慮替代方法和概念。為了評估這些新診斷概念的質(zhì)量，首先要根據(jù)要檢測的每毫升賊小病毒顆粒濃度來定義目標靈敏度，該值如何與每毫升噬菌斑形成單位 (PFU mL ^-1 ) 和RT-PCR對循環(huán)閾值 (C _t ) 值的校正可能是什么。人們認為傳染性在癥狀出現(xiàn)前 2-3 天開始，人們在癥狀出現(xiàn)時賊具傳染性（圖1）。無癥狀和有癥狀的 SARS-CoV-2 感染可以具有不同的特征傳播時間尺度，無癥狀個體的平均感染期約為 9-10 天 ，而有癥狀的感染期約為 1-4 天 。

圖1：Ct 值的臨床意義以及與病毒 RNA 拷貝以及斑塊形成單位 (PFU) 的相關(guān)性：( a ) 考慮到SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組自己和其他人的發(fā)現(xiàn) 的 SARS-CoV-2 感染性時間表。( b ) 在 COVID-19 患者的鼻咽拭子標本中，Ct 值隨時間的變化而變化。( c ) Ct 計數(shù)與病毒 RNA 拷貝的相關(guān)性。( d ) 病毒 RNA 拷貝 mL ^{-1的相關(guān)性}用 SARS-CoV-2 的斑塊形成單位 (PFU) 作為傳染性的衡量標準。Vero E6 細胞被 10 倍稀釋的 SARS-CoV-2 分離株 20A.EU2（EU 變體）感染。通過 Spearman 和 Karber 方法計算估計的病毒濃度，并表示為 TCID50/mL (1 pfu mL ^-1 = TCID50/mL × 0.7)。結(jié)果表示為每組至少三個獨立測量值的平均值±SEM。

因此，考慮病毒診斷敏感性的一個基本問題與如何比較/關(guān)聯(lián)從不同方案和病毒樣本獲得的 RT-PCR 中的循環(huán)閾值 (Ct) 值的問題 。這個練習(xí)仍然很復(fù)雜，因為只有了解患者的健康史才能正確解釋 Ct 值 。在考慮 Ct 臨界值和診斷敏感性時，構(gòu)成傳播風(fēng)險的病毒載量范圍的不確定性是另一個因素 。人們在癥狀出現(xiàn)時賊具傳染性（圖1a)，上呼吸道病毒載量賊高的人群 。漸近個體遵循類似的動態(tài)，并以與癥狀前個體相同的方式對病毒傳播做出貢獻。普遍認為 Ct 值與 SARS-CoV-2 病毒載量有關(guān)，Ct 為 33-35 與低傳染性有關(guān)，Ct 值 < 20 與高病毒載量有關(guān)，Ct = 40 為臨界值在積極和消極識別的個體之間。賊近，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組中的一些人 [ 16 ] 使用來自 520 名 COVID-19 患者的數(shù)據(jù)證實了 SARS-CoV-2 RNA 的時間線（圖1B）。與賊高病毒載量相對應(yīng)的賊低 Ct 值在癥狀發(fā)作后早期記錄，隨后隨著癥狀發(fā)作后時間的增加病毒載量下降。

為了將 Ct 值與病毒粒子的先進數(shù)量相關(guān)聯(lián)，可以并行確定病毒 RNA 拷貝的數(shù)量（圖1C）。正如所料，觀察到RT-PCR Ct值和病毒RNA拷貝mL ^-1之間的線性關(guān)系。因此，Ct 值對應(yīng)于 2.1 × 10 ³病毒 RNA mL ^-1，而 Ct = 12 對應(yīng)于 7.1 × 10 ⁹病毒 RNA mL ^-1. 病毒 RNA 的存在并不一定意味著感染性病毒粒子的存在。病毒粒子可能有缺陷（例如，通過突變）或可能已因環(huán)境條件失活。因此，使用病毒 RNA 拷貝作為傳染性病毒顆粒數(shù)量的近似值會導(dǎo)致高估。在解釋有關(guān)病毒載量的數(shù)據(jù)時，記住這一點很重要。然而，對于許多病毒來說，即使是小劑量的病毒粒子也會導(dǎo)致感染。例如，對于普通感冒，~0.1 TCID ₅₀足以感染一半的暴露人群 。為了評估感染性病毒的濃度，50% 組織培養(yǎng)感染劑量與 1 PFU mL ^-1 = TCID ₅₀/mL × 0.7 必須通過用稀釋的病毒感染易感細胞的復(fù)制培養(yǎng)物并注意一半復(fù)制培養(yǎng)皿被感染的稀釋度來確定。圖1d表示2.1×10 ³病毒顆粒mL ^-1不會產(chǎn)生可口的病毒。形成1 PFU mL ^-1的開始對應(yīng)于(4.0±1.9)×10 ⁴病毒顆粒mL ^-1的賊小病毒顆粒載量。這與大約 Ct = 32 ± 1 相關(guān)。在 Pickering 等人賊近的炒鍋中。，30 的 Ct 值與 1 PFU mL ^-1和 5 × 10 ⁴ RNA 病毒顆粒 mL ^-1相關(guān)。病毒顆粒載量與SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組的發(fā)現(xiàn)非常相關(guān)。Ct 值的差異與所使用的不同片段有關(guān)，即 Pickering 等人的 N 基因。 和SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組的 IP 目標。這種基準測試對于評估新的傳感方法及其性能水平非常重要。對于 RT-PCR，每毫升 100 個病毒 RNA 拷貝對應(yīng)于陽性結(jié)果。此外，血清學(xué)檢測可以提供有關(guān)免疫反應(yīng)的有價值信息，是對 SARS-CoV-2 RNA 檢測的良好補充。事實上，隨著患者的康復(fù)，病毒載量開始下降，而免疫球蛋白水平會增加，直到癥狀出現(xiàn)后約 10 天。在這個時間點可以進行血清學(xué)測試。

在大多數(shù)情況下，SARS-CoV-2 會導(dǎo)致輕微或無癥狀的疾?。蝗欢?，嚴重到危重的疾病發(fā)生在一小部分感染者身上，70歲以上的人發(fā)病率賊高。與其他病毒相比，SARS-CoV-2 的繁殖率中等，為R ₀ = 2.5，而SARS-CoV 和 1918 年流感大流行的R _{0 = 2 0-3 0，MERS-CoV 的}R ₀ = 0·9對于 2009 年流感大流行  ，R _{0 = 1·5}]。一般而言，對于一種快速傳播的疾病，例如 SARS-CoV-2，遏制其傳播的賊有效方法是早期發(fā)現(xiàn)以隔離患者。COVID-19 診斷的金標準是對從疑似個體的上呼吸道采集的鼻咽拭子中的病毒 RNA 進行基于核苷酸的檢測 (qRT-PCR)。除了病毒 ssRNA，大多數(shù) FDA 批準的商業(yè)抗原試劑盒都針對核衣殼（圖 2）。

圖 2：用于傳感的 SARS-CoV-2 結(jié)構(gòu)蛋白：病毒復(fù)制需要其他輔助基因，包括開放閱讀框 1a (ORF1a)、ORF1b 和 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp)。

SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白緊挨著刺突糖蛋白（S1、S2）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。M蛋白是病毒顆粒上賊豐富的蛋白質(zhì)，E蛋白是病毒顆粒賊小的主要結(jié)構(gòu)蛋白。S包膜蛋白由兩個功能亞基S1和S2組成；S1 亞基與宿主細胞受體結(jié)合，而 S2 亞基與病毒和細胞膜融合。S 蛋白仍然是感染后中和抗體治療的主要目標，也是疫苗和治療設(shè)計的重點。它也是開發(fā)診斷方法的主要目標，但尚未廣泛整合到主要基于靶向核衣殼蛋白的商業(yè)抗原試劑盒中。N蛋白確實是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，負責(zé)病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，將包膜基因組包裝成病毒顆粒，并與宿主細胞的細胞周期相互作用。它也是病毒感染期間產(chǎn)生和釋放的賊豐富的蛋白質(zhì)，可以在感染的賊初幾個小時內(nèi)在血清和尿液中檢測到，在感染后約 10 天達到賊大值。此外，每個 SARS-CoV-2 病毒粒子上僅存在約 100 個刺突三聚體，估計總共有 300 個單體，可作為傳感的靶點，而每個病毒粒子中表達約 1000 個核衣殼拷貝。將包膜基因組包裝成病毒顆粒并與宿主細胞的細胞周期相互作用。它也是病毒感染期間產(chǎn)生和釋放的賊豐富的蛋白質(zhì)，可以在感染的賊初幾個小時內(nèi)在血清和尿液中檢測到，在感染后約 10 天達到賊大值。此外，每個 SARS-CoV-2 病毒粒子上僅存在約 100 個刺突三聚體，估計總共有 300 個單體，可作為傳感的靶點，而每個病毒粒子中表達約 1000 個核衣殼拷貝。將包膜基因組包裝成病毒顆粒并與宿主細胞的細胞周期相互作用。它也是病毒感染期間產(chǎn)生和釋放的賊豐富的蛋白質(zhì)，可以在感染的賊初幾個小時內(nèi)在血清和尿液中檢測到，在感染后約 10 天達到賊大值。此外，每個 SARS-CoV-2 病毒粒子上僅存在約 100 個刺突三聚體，估計總共有 300 個單體，可作為傳感的靶點，而每個病毒粒子中表達約 1000 個核衣殼拷貝。_ 賊近在內(nèi)部開發(fā)的 SARS-CoV-2 抗原測試和針對核衣殼蛋白的可比測試  中使用單克隆抗尖峰抗體  進行了比較，特別是使用了一種新型單克隆抗體親和常數(shù) K _D= 0.7 海里。大多數(shù)商業(yè)化驗中的抗原選擇，核衣殼被證實具有比基于穗的化驗更高的靈敏度。然而，基于尖峰的檢測明顯比基于核衣殼的檢測更具特異性。由于已發(fā)現(xiàn)逃逸突變體表現(xiàn)在這些尖峰以及核衣殼蛋白中，因此在同一診斷設(shè)備上組合兩種抗原可能是前進和加強 COVID-19 測試高效性的方法，這是賊近提出的一種方法蔡等人。那么，在使用 S 和 N 蛋白靶標的酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 和 PCR 的替代方案方面，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組處于什么位置？

SARS-CoV-2 病毒顆粒的高效檢測方法可以看作是對其他綜述的補充，賊近的臨床樣本結(jié)果  強調(diào)了便攜式 SPR 作為病毒診斷設(shè)備的巨大潛力。特別關(guān)注 SPR 表征生物受體和 COVID-19 靶標之間親和力常數(shù)的潛力，這一方面通常沒有更詳細地描述。然而，局部表面等離子共振 (LSPR) 傳感器不會被討論，大量信息可以在 Takemura 的論文中找到 。審查將主要關(guān)注 SPR 對 SARS-CoV-2 病毒顆粒的檢測。雖然基因仍然是賊廣泛使用的病毒生物標志物之一，但已經(jīng)實施了更靈敏、更新穎的病毒基因檢測方法 ，例如CRISPR相關(guān)蛋白9與SPR  ，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組認為，如果在檢測時進行以 SARS-CoV-2 蛋白（例如 S 和 N 蛋白）的存在為重點的分子檢測，以識別那些在檢測時被感染的個體，則在直接與傳染性相關(guān)聯(lián)方面更有效。定量或至少半定量的方式。在接下來的討論中，將重點關(guān)注基于病毒粒子的 SPR 傳感。

2. 表面等離子共振作為結(jié)合動力學(xué)分析的工具

生物配體開發(fā)的關(guān)鍵是了解生物受體與目標（分析物）之間的結(jié)合相互作用強度。經(jīng)典的生化方法，例如蛋白質(zhì)印跡和免疫共沉淀方法，只能判斷生物分子之間是否發(fā)生結(jié)合。ELISA 提供更詳細的信息，例如結(jié)合親和力，但并非沒有復(fù)雜且耗時的基于酶的擴增和標記步驟。SPR 的優(yōu)勢，可商用超過 30 年，是它以無標簽的方式正確地揭示了結(jié)合相互作用。在經(jīng)典的基于金棱鏡的 SPR 方法中，該信息是通過將分析物流過用生物受體修飾的 SPR 棱鏡獲得的。由于生物受體-分析物相互作用，分析物在傳感器表面的積累導(dǎo)致傳感器表面附近的折射率增加，從而導(dǎo)致 SPR 條件實時變化，并在幾分鐘內(nèi)提供有關(guān)結(jié)合效率的信息。該方法需要賊少量的樣品進行結(jié)合動力學(xué)實驗，并在不使用熒光、磁性或放射性標記的情況下提供有關(guān)結(jié)合和解離事件速率的信息?？梢允褂貌煌谋砻婊瘜W(xué)方法將少量不同的生物受體集成到 SPR 傳感器上，從使用經(jīng)典抗體和工程抗體  到 DNA 、適體 、糖  等。近年來，隨著 SPR 分析的成本和復(fù)雜性大大降低負擔(dān)得起的便攜式 SPR 技術(shù)的出現(xiàn)。然而，直到賊近的成就，SPR 方法仍然沒有用于檢測單個病毒顆粒和一般低病毒顆粒濃度。由于它們的快速檢測和量化對于正確的疾病診斷仍然非常重要，例如 COVID-19，賊近已經(jīng)描述了在這個方向上的不同努力，并將在下面更詳細地討論。

SARS-CoV-2 病毒顆粒的等電點 pI 為 10.07，在生理 pH 值下帶正電荷 ?？赡軙l(fā)生與適體帶負電荷的骨架的非特異性相互作用，需要設(shè)計高度特異性的生物受體。少數(shù)針對刺突蛋白和 N 蛋白的 SARS-CoV-2 適體確實有報道。在這種情況下，SPR 被證明是了解受體結(jié)合域 (RBD) 與 SARS-CoV-2 的完整 S1 蛋白和表面生物受體之間親和力的有效工具，優(yōu)先固定在 SPR 表面芯片使結(jié)合動力學(xué)分析可與未來的等離子體傳感相媲美。在 20 堿基適體“CFA0688T”（堿基對生物）的情況下，在 5' 末端用硫醇-TTT-TTT 修飾一個環(huán)，以賦予適體一些靈活性，使其錨定在金界面上，結(jié)合親和力重組 SARS-CoV-2 S1 刺突蛋白測定為K _D = 3.4 ± 0.2 nM (R ² = 0.9985) (圖 3A）。SARS-CoV-2 適體與金 SPR 芯片的連接是基于馬來酰亞胺-硫醇化學(xué)，首先將 3-巰基丙酸偶聯(lián)到金芯片上，然后是 EDC/NHS 連接馬來酰亞胺-PEG _6-胺。圖 3A）。

圖 3：SPR 作為確定 SARS-CoV-2 生物受體和病毒蛋白之間親和力的寶貴工具：( a ) S1 刺突蛋白與來自 BasePairBio 的 20 堿基適體“CFA0688T”的結(jié)合動力學(xué)的 SPR 傳感圖以及表面化學(xué)結(jié)構(gòu)。( b ) N 蛋白特異性適體與 SARS-CoV-2 N 蛋白修飾的 SPR 芯片（使用 EDC/NHS 化學(xué)的 CM5 芯片）結(jié)合動力學(xué)的 SPR 傳感圖，傳感器芯片上飛過一系列不同的適體（轉(zhuǎn)載于來自 Ref. 的許可），2020，RSC，（c）單層和二聚體 ACE-2 修飾的 SPR 芯片的 SPR 分析示意圖以及結(jié)合動力學(xué)（經(jīng) Ref. , 2021, ACS 許可轉(zhuǎn)載）。

Zhang 等人報道了一個 58 堿基 N 蛋白特異性適體 (A48)，K _D為 0.49 nM，k _on = 8.80 × 10 ⁵ M ^-1 s ^-1和k _off = 3.48 × 10 ^-4 s ^-1，由 SPR 確定。然而，在這個實驗中，N 蛋白使用典型的 EDC/NHS 協(xié)議附著在表面上，并且適體在表面上流動（圖 3B）。通過采用這種方法，可以評估不同適配體和 N 蛋白之間夾心型結(jié)合的可能性。在先進次運行中，適體 A48 飛過通道，導(dǎo)致 47 RU 的移位。在接下來的運行中，第二個特定于 N 蛋白的適體在同一通道上飛行。如果此適配體與蛋白質(zhì)的不同表位結(jié)合，則響應(yīng)信號應(yīng)具有第二個平臺，這在 A58、A61 中觀察到，但在 A15 和 A48 作為對照時沒有觀察到。

同樣，SPR 被用于對 SARS-CoV-2 刺突蛋白和人類受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2 (ACE-2)  的親和力誘導(dǎo)的親和力增強的去卷積。事實上，與其他冠狀病毒類似，SARS-CoV-2 包膜的糖基化刺突蛋白與宿主 ACE-2 受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒顆粒與宿主細胞膜的融合。研究表明，與 SARS-CoV 相比，SARS-CoV-2 RBD 的嵌合結(jié)構(gòu)對 ACE-2 具有更高的結(jié)合親和力 。Geschinder 及其同事 指出，通常認為的分離的刺突蛋白 RBD 與單個 ACE-2 單體之間的 1:1 結(jié)合相互作用過于簡單化，并沒有考慮親和力效應(yīng)。通過設(shè)計有利于全長 S 蛋白和 ACE-2 之間的單價相互作用事件的傳感器表面以及有利于產(chǎn)生多價效應(yīng)的表面，K _D在先進種情況下確定為 60 nM，而在多價情況下，信號占 125 nM 親和力相互作用 (62%)，但也占 4 nM 親和力 (28%)。在下文中，單體和多聚體 ACE-2 物種與開關(guān)抗生物素蛋白修飾的 SPR 芯片相關(guān)聯(lián)，從而可以解決每個表面上的多個結(jié)合事件。在二聚體 ACE-2 表面，觀察到 283 pM 的高親和力，主要是由于較低的k_{關(guān)閉}率（圖 3C）。

除了適體和 ACE-2，研究賊廣泛的 SARS-CoV-2 生物受體仍然是抗體和工程抗體。在這方面，納米抗體引起了廣泛的興趣，SPR 主要用于獲得它們對 RBD 和 SARS-CoV-2 的全長 S1 蛋白的親和力特征。SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組選擇 VHH-72 (PDB ID 6WAQ) ，一種抗 SARS-CoV-1 抗尖峰納米體，可交叉中和 SARS-CoV-2，用于基于 SPR 的調(diào)查和傳感。盡管 VHH-72 對 SARS-CoV-2 RBD 具有納摩爾親和力，快速解離被認為會對基于 SPR 的傳感產(chǎn)生負面影響。此外，生物傳感器的一個常見缺點是使用 EDC/NHS 將蛋白質(zhì)（如 VHH-72）固定在傳感器上。VHH-72 的隨機附著賊有可能降低大目標的結(jié)合效率，例如 SARS-CoV-2 病毒顆粒。免疫球蛋白或 Fab 片段是賊喜歡的表面結(jié)合劑候選物，允許納米抗體的識別表位朝向溶液，從而朝向病毒靶標。由于人 IgG1 的 Fc 結(jié)構(gòu)域通過 HHHHHHRENLYFQG 接頭與 VHH 結(jié)構(gòu)域遺傳連接，VHH-72-Fc 的二價導(dǎo)致納摩爾親和常數(shù)K _D = 1.5 × 10 ^-9 M，k_在1.2 × 10 ⁵ M ^-1 s ^-1和改進的k _off等于 1.8 × 10 ^-4 s ^-1 (圖 4A）。

圖 4：不同工程 SARS-CoV-2 抗體的親和力：( a ) 納米抗體 VHH-72-Fc 與傳感圖的定向連接（經(jīng) Ref. , 2022, RSC 許可轉(zhuǎn)載）。( b ) nanoCLAMP P2712L (6His-P2710-linker-P2609-linker-Cys) 與武漢-RBD的結(jié)合親和力。金芯片用馬來酰亞胺接頭修飾。運行緩沖液：20 mM MOPS、150 mM NaCl、1 mM CaCl ₂和 1% BSA 作為封閉劑（pH 6.5）。黑線描繪綁定數(shù)據(jù)，紅線顯示 1:1 綁定模型擬合。

賊近，新的 SARS-CoV-2 RBD 特異性抗體模擬物被稱為 nanoCLAMP（納米梭菌抗體模擬蛋白）與 SPR 。nanoCLAMP 源自透明質(zhì)酸梭菌的免疫球蛋白樣碳水化合物結(jié)合模塊，是 4 nm × 2.5 nm 的抗體模擬物，與其他抗體模擬物和納米抗體相比具有明顯的優(yōu)勢。它們可以在短短 6 周內(nèi)從幼稚的噬菌體展示文庫中篩選出高特異性靶標親和力。它們從大腸桿菌的胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生價格便宜，產(chǎn)量超過 200 g/L。> 75°C的高熔點使其在室溫下穩(wěn)定，因此非常適合傳感器開發(fā)，因為修改后的界面可以在室溫下長時間儲存??而不會降低其傳感性能。nanoCLAMP 中不存在其他半胱氨酸單元，使得基于半胱氨??酸的表面附著特別容易，因為還原劑（如 DTT）不會改變蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)。賊近測試了具有半胱氨酸末端的親和力成熟 nanoCLAMP，nanoCLAMP P2712 (6His-P2710-linker-P2609-linker-Cys)，武漢 RBD 的K _D為 80 pM。圖 4乙）。該配體通過其單個 C 端 Cys 共價結(jié)合到用馬來酰亞胺單元修飾的金芯片上，此外，在用 6 M GuHCl/0.1 N NaOH 化學(xué)變性后，可以很容易地在表面上重新折疊。

3. SARS-CoV-2 的等離子體傳感器

COVID -19 特異性和高親和力生物標志物的開發(fā)不僅對治療設(shè)計有用，而且已成為等離子 SARS-CoV-2 傳感器的重要組成部分。SPR 的先進個例子，特別是基于強度調(diào)制的 SPR 病毒傳感，是 Chang 等人報道的。。提出了一種基于抗體的 H7N9 病毒傳感，檢測限為 144 拷貝 mL ^-1，與使用相同抗體的自制靶標捕獲 ELISA 相比，靈敏度提高了 20 倍。這些傳統(tǒng)的 SPR 測試機器相當(dāng)笨重，不適合在臨床環(huán)境中實施。因此，在研究實驗室中進行的 SPR 病毒檢測方案很少被認為是可行的方法，并且可用于臨床和護理點應(yīng)用。Huang 等人提出了一種低成本的納米等離子傳感器，可以一步快速檢測和量化 SARS-CoV-2 假病毒。該概念基于用抗體修飾的金納米杯陣列。SARS-CoV-2 與它的附著會導(dǎo)致等離子共振波長和強度發(fā)生變化。與用 ACE-2 蛋白修飾的金納米顆粒的進一步相互作用導(dǎo)致靈敏的夾心測定法，其傳感能力范圍為 10 ² –10 ^{7 個}病毒顆粒 mL ^-1，檢測限為 370 個假病毒顆粒 mL ^-1 (表1) 15 分鐘內(nèi) (圖 5A）。石墨烯涂層 SPR 由 Akib 等人提出。用于 COVID 傳感 ，主要關(guān)注石墨烯 SPR 優(yōu)勢的展示，而不是病毒樣本的真實傳感。

表1:不同SARS-CoV-2檢測原理的比較

EC = 電化學(xué)；GFET = 基于石墨烯的場效應(yīng)晶體管；RT-LAMP：逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增。

圖 5:應(yīng)用于 SARS-CoV-2 傳感的便攜式 SPR 概念：( a ) 用于在三明治分析中檢測 SARS-CoV-2 病毒顆粒的納米等離子共振傳感器原理以及已開發(fā)的傳感器芯片盒的照片，該盒將插入到帶有智能手機的手持設(shè)備，用于讀取數(shù)據(jù)并將曲線與不同的 SARS-CoV-2 偽病毒顆粒濃度結(jié)合（經(jīng)參考文獻 , 2021, Elsevier 許可轉(zhuǎn)載）。（b）（左）桌面 SPR 的圖像具有基于墨盒的傳感能力的 POC 測試設(shè)備。（中）培養(yǎng)的 SARS-CoV-2 病毒顆粒流經(jīng) VHH-72-Fc 修飾的基于墨盒的 SPR 芯片時的 SPR 傳感圖（圖 4b)、含有 0.01 M HEPES、0.15 M NaCl 和 0.05% v / v表面活性劑 P20 的運行緩沖液 HBS-P + 1× 以及 RT-qPCR 陽性 (50) 和陰性 (69) 鼻咽樣本和 SPR 數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性. 陽性和陰性之間的截止值為 186 RIU（紅線）。

正如 Jean-Francois Masson 賊近的一篇評論所述，等離子傳感器非常適合小型便攜式診斷設(shè)備 。該領(lǐng)域賊近從使用基于棱鏡的方法發(fā)展到使用等離子體納米材料、光纖和智能手機作為診斷系統(tǒng)中的光學(xué)組件 。實際上，等離子體裝置可以在性能損失有限的情況下縮小規(guī)模，因為光學(xué)測量更依賴于波長或等離子體共振角位移而不是強度。因此，只要檢測器的靈敏度不受影響，信噪比就會保持不變。使用廉價的發(fā)光二極管 (LED) 光源而不是激光與小型 USB 光譜儀  甚至智能手機用于讀出使儀器便攜且成本低。此外，傳感器芯片可以在不損失分析靈敏度的情況下縮小尺寸，因為等離子體的傳播長度在幾十微米范圍內(nèi)。當(dāng)使用一次性鍍金底漆時，可以避免使用不整潔且會干擾光學(xué)讀數(shù)的折射率匹配流體 。圍繞樣品處理，SPR 的成本及其復(fù)雜性仍有待提高。便攜式設(shè)備中的流體處理應(yīng)在低壓下或什至不需要泵，例如將分析物被動運輸?shù)絺鞲行酒?。此外，即使對于便攜式 SPR 設(shè)備，可重現(xiàn)和面向生物受體的表面化學(xué)仍然是針對每種分析物進行優(yōu)化的賊終步驟。深度學(xué)習(xí)和機器學(xué)習(xí)方法的整合以提高 SPR 的檢測特性正在成為更快和可持續(xù)傳感的重要和不可或缺的部分。已經(jīng)報道了一些便攜式等離子體設(shè)備，例如 Guner 等人的基于智能手機的 SPRI。，顯示折射率變化低至 4.12 × 10 ^-5 RIU，與商業(yè)儀器的性能以及 PhotonicSys SPR H5 的小型化平臺的性能相當(dāng)、Affinité Instrument或Phaselab Instruments的相敏緊湊型 IPOS-Lab SPR 。在 Affinité Instrument 的情況下，光譜 SPR 信號中的賊小值使用專有算法跟蹤，該算法提供 0.004 nm 的賊終儀器分辨率，噪聲水平 < 5 RIU。

使用便攜式 SPR 進行診斷也是 COVID-19 大流行期間研究的重點。SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組賊近以感知 SARS-CoV-2 的 S1 蛋白的存在為例，舉例說明了如何打破常規(guī)和便攜式 SPR 在臨床環(huán)境中實施的缺陷。為了演示如何實施便攜式 SPR 技術(shù)以通過 S1 刺突蛋白感知 SARS-CoV-2 病毒顆粒，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組賊近重點關(guān)注了將 SPR 提升到 POC 測試水平的三個重要科技要素：一種對 SARS-CoV-2 的包膜 S1 蛋白具有高親和力的工程抗體和傳感盒的使用，這是實現(xiàn)賊先進的即時傳感的首要儀器考慮之一。圖 4b）。用于預(yù)測陽性和陰性鼻咽拭子樣本之間的截止值的機器學(xué)習(xí)的實施被證明對于提高傳感器的性能也是必不可少的。當(dāng)暴露于不同濃度的培養(yǎng)的 SARS-CoV-2 病毒顆粒（進化枝 20A.EU2，EU 變體）時，仍可將 5.9 × 10 ⁴病毒顆粒 mL ^-1的樣本與噪聲區(qū)分開來，即 RU = 10 (圖 5b)，并與 Ct = 32 左右的 RT-qPCR 值相關(guān)。為了進一步推動分析，殺死 50% 的 Vero E6 細胞所需的病毒顆粒數(shù)量允許確定感染滴度，發(fā)現(xiàn)為 10 PFU mL ^-1用于 5.9 × 10 ⁴病毒顆粒 mL ^-1。

此外，基于盒式傳感器的臨床性能還對 50 個鼻咽拭子樣本（25 個陽性和 25 個陰性樣本，通過從臨床測試機構(gòu)的患者收集的 RT-qPCR 鑒定）進行了評估。使用 186 RU 的截止值 (圖 5b) 從經(jīng) RT-qPCR 確認為陽性的 50 份鼻拭子樣本中，有 4 份被鑒定為 COVID-19 陽性。根據(jù) RT-qPCR，在 25 個樣本中正確識別出 21 個樣本，確定了 84% 的陽性百分比一致性 (PPA)。在 RT-qPCR 確認為陰性的 25 個鼻樣本中，有 6 個被 SPR 鑒定為陰性，顯示 76% 的陰性百分比一致性 (NPA)。使用具有 250 毫秒采樣時間和 1 分鐘采集時間而不是 15 分鐘的機器學(xué)習(xí)算法，仍然可以匹配相同的結(jié)果。有趣的是，基于墨盒的傳感器的結(jié)果與使用微流體通道的 SPR 的結(jié)果相當(dāng)。由于獨特的靈敏度和與橫向流動分析相當(dāng)?shù)捻憫?yīng)時間，這項工作開辟了 SARS-CoV-2 感染的即時檢測的可能性，并可能大大增加病毒診斷方案。

從這個和其他 COVID-19 SPR 傳感器的性能與其他替代便攜式傳感方法的比較可以看出表1. 事實上，RT-PCR 仍然是病毒診斷賊敏感的方法。比較使用相同表面配體的光學(xué)  和電化學(xué)傳感器得出了相當(dāng)?shù)撵`敏度。它們都優(yōu)于基于橫向流動的測定。

4. SARS-CoV-2 病毒顆粒結(jié)論和觀點

目前，已經(jīng)開發(fā)了各種商業(yè) POCT 設(shè)備，用于檢測早期流行病爆發(fā)。微流體、微電子機械系統(tǒng)技術(shù)、納米技術(shù)和 3D 打印的創(chuàng)新進展，以及數(shù)據(jù)分析和高效表面配體的開發(fā)，在過去兩年顯著促進了 POCT 診斷的發(fā)展。POCT在全球范圍內(nèi)仍處于起步階段，未來需要解決技術(shù)進步問題。這也適用于基于 SPR 的傳感器。雖然仍然主要是基于研究的儀器，但便攜式表面等離子體共振設(shè)備已被證明對當(dāng)前的 SARS-CoV-2 大流行具有重要價值。SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組希望在這里展示傳統(tǒng) SPR 測試的一些缺點，諸如笨重的儀器及其在臨床環(huán)境中難以實施的問題，已通過這種小型化方法部分克服。它們的小型化特性與足夠的表面結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使其能夠在 3 級生物安全條件下實施，以篩選新的生物受體對不同病毒表位的親和力，并產(chǎn)生一些敏感的 SARS-CoV-2 診斷平臺。憑借低至 10 PFU/mL 的高效 SPR 測試，它們可以被視為側(cè)流抗原測定的替代方案，其中賊高效的測試檢測 50 PFU/mL 相當(dāng)于約 3 × 10 它們的小型化特性與足夠的表面結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使其能夠在 3 級生物安全條件下實施，以篩選新的生物受體對不同病毒表位的親和力，并產(chǎn)生一些敏感的 SARS-CoV-2 診斷平臺。憑借低至 10 PFU/mL 的高效 SPR 測試，它們可以被視為側(cè)流抗原測定的替代方案，其中賊高效的測試檢測 50 PFU/mL 相當(dāng)于約 3 × 10 它們的小型化特性與足夠的表面結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使其能夠在 3 級生物安全條件下實施，以篩選新的生物受體對不同病毒表位的親和力，并產(chǎn)生一些敏感的 SARS-CoV-2 診斷平臺。憑借低至 10 PFU/mL 的高效 SPR 測試，它們可以被視為側(cè)流抗原測定的替代方案，其中賊高效的測試檢測 50 PFU/mL 相當(dāng)于約 3 × 10⁶RNA 拷貝/mL。多通道和多分析物分析的可能性可能會在臨床環(huán)境中為 SPR 提供額外的優(yōu)勢。在歐盟資助的項目 CorDial-S 下，至少以一種方法對臨床性能進行了更密切的測試。對 119 份鼻咽拭子樣本的評估達到了 88% 的陽性百分比一致性 (PPA) 和 92% 的陰性百分比一致性 (NPA)。傳感器只能使用一次，因為表面的再生會導(dǎo)致性能下降，即 86% 的正百分比一致性 (PPA) 和 82% 的負百分比一致性 (NPA)。有趣的是，表面的再生主要對負樣本產(chǎn)生了很大的影響，得到了假陽性反應(yīng)。在重復(fù)使用的接口上篩選的 50 個陰性樣本中，有 41 個被 RT-PCR 和 SPR 指定為陰性。

有了這些結(jié)果，SPR 在病毒檢測中的觀點是什么？基于 SPR 的生物傳感器的液體樣品體積和功耗仍然是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的主要瓶頸。為了克服這些缺點，必須考慮改進和緊湊的微流體裝置，如無動力泵系統(tǒng)，用于下一代基于 SPR 的集成生物傳感器。使用傳感盒是 Affinité Instruments 與SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測方法重點攻關(guān)課題組一起為減少昂貴泵的實施而進行的一項嘗試。這些一次性 SPR 傳感器是用于快速單點測量的低成本且易于使用的傳感設(shè)備。如果超靈敏度成為一個重要參數(shù)，則需要在該領(lǐng)域?qū)⒓{米材料集成到基于 SPR 的傳感器中。將磁場整合到 SPR 中并使用磁性粒子可能是改進病毒傳感的一種方式。賊近研究了一種磁增強 SPR (M-SPR)（未發(fā)表的數(shù)據(jù)），結(jié)果表明其檢測限低至 1.5 × 10^3個病毒顆粒mL ^-1，比常規(guī)SPR的檢測限低兩個數(shù)量級，為5.9×10 ^{4 個}病毒顆粒mL ^-1。這個和其他概念將允許在未來推動 SPR 領(lǐng)域。

可以推斷，等離子方法也可能適用于 COVID 后危機，特別是為區(qū)分長期 COVID 患者和其他患者提供診斷參數(shù)?，F(xiàn)在已經(jīng)認識到，許多感染 SARS-CoV-2- 的患者會在賊初感染幾個月后出現(xiàn)急性后 COVID 綜合征。這一健康階段稱為長期 COVID，發(fā)生在 30-50% 的 COVID-19 患者中，其特點是多系統(tǒng)癥狀、持續(xù)疲勞和認知障礙，隨著年齡和女性性別的增加而更加普遍。盡管早期的印象是長期 COVID 只能在住院和插管的患者中發(fā)展，但越來越多的證據(jù)表明，無論原始癥狀的嚴重程度如何，長期 COVID 都可以發(fā)展 。

其他與本文內(nèi)容相關(guān)的科學(xué)證據(jù)：

Biosensors (Basel). 2022 Jul; 12(7): 548.

Published online 2022 Jul 21. doi: 10.3390/bios12070548

Plasmonic Approaches for the Detection of SARS-CoV-2 Viral Particles