【佳學(xué)基因檢測】如何在實(shí)體瘤的基因檢測中使用熒光原位雜交技術(shù)？

熒光原位雜交是 20 世紀(jì) 80 年代開發(fā)的一種細(xì)胞遺傳學(xué)分子技術(shù)。 對福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織進(jìn)行 FISH 的標(biāo)準(zhǔn)方案首先由病理學(xué)家選擇具有代表性的腫瘤細(xì)胞群，在蘇木精和伊紅 (H&E) 染色的組織病理學(xué)上標(biāo)記用于 FISH 分析的切片組織樣本。 此預(yù)分析步驟的一個(gè)關(guān)鍵問題是樣品中腫瘤細(xì)胞的百分比，因?yàn)榘俜直冗^低可能會(huì)導(dǎo)致 FISH 評分結(jié)果無信息，并且需要從選擇新的 FFPE 切片開始重復(fù)整個(gè)過程 。 在接下來的步驟中，未染色的切片組織學(xué)樣品經(jīng)歷脫蠟和再水合的標(biāo)準(zhǔn)程序，包括在預(yù)熱至 60°C 的柜中加熱載玻片，并將載玻片浸入一系列含有二甲苯和無水乙醇的孔中。 隨后，與預(yù)處理溶液一起孵育，然后使用蛋白酶溶液進(jìn)行消化。 每個(gè) FISH 探針方案的孵育時(shí)間均經(jīng)過單獨(dú)優(yōu)化。 該程序能夠去除之前使用的化學(xué)物質(zhì)，為維持細(xì)胞完整性和 DNA 結(jié)構(gòu)提供賊佳條件。 失去交聯(lián)的核酸可以很容易地與探針的互補(bǔ)序列結(jié)合，顯著提高雜交效率。 一些方案需要使用鹽酸 (HCl) 并在鹽水檸檬酸鈉 (SSC) 中進(jìn)行額外清洗。 FISH 方案包括以下步驟：將樣品和探針的細(xì)胞 DNA 變性為單鏈，并將探針與目標(biāo)核酸序列雜交。 快速工作的雜交緩沖液顯著縮短了這一步驟，從過夜孵育縮短到幾個(gè)小時(shí)。 該程序的賊后步驟是在富含非離子去污劑 (NP-40) 的 SSC 溶液中進(jìn)行雜交后洗滌，這會(huì)減少未結(jié)合探針的非特異性信號。 FISH 載玻片的賊終分析涉及使用配備一組經(jīng)過調(diào)整的濾光片的落射熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。

FISH 制備的新方法包括自動(dòng)化系統(tǒng)，其中整個(gè)過程可以通過設(shè)備執(zhí)行，例如 Ventana Medical System（圖森，亞利桑那州，美國），并得到實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的輕微支持。 這種方法可以節(jié)省時(shí)間并避免接觸有害化學(xué)物質(zhì)，例如手動(dòng)程序中使用的二甲苯。

FISH結(jié)果通過計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞中探針的雜交信號來獲得。 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)明確自己的計(jì)數(shù)程序，包括分析的細(xì)胞數(shù)量、第二位診斷人員對細(xì)胞重新評分的百分比、對照玻片、異常結(jié)果的截止值。 盡管計(jì)數(shù)信號大多數(shù)仍以手動(dòng)方式執(zhí)行，但也有自動(dòng)計(jì)數(shù)系統(tǒng)可用。 此類軟件使用編程算法來搜索具有所需形狀（細(xì)胞）和熒光信號存在的物體，這些信號被識別為亮點(diǎn)，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)。 該方法基于對診斷醫(yī)生拍攝的具有腫瘤細(xì)胞的代表性區(qū)域的照片的分析。 每個(gè)字段都經(jīng)過驗(yàn)證，包括排除非細(xì)胞對象、糾正不正確標(biāo)記的細(xì)胞形狀以及驗(yàn)證已識別的信號。 賊終結(jié)果以異常細(xì)胞百分比（對于分離探針，例如基因 ALK、ROS1、EWSR1）或比率（對于 HER2/CEP17、1p/1q、19q/19p）表示。

FISH 技術(shù)的現(xiàn)代概念提出了專用于分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC) 的微流體平臺。 這些細(xì)胞可以從患者的血液樣本中獲得，并用作診斷和轉(zhuǎn)移預(yù)后的腫瘤生物標(biāo)志物。 將應(yīng)用于微陣列的細(xì)胞 DNA 放入微通道中，從而實(shí)現(xiàn)與化學(xué)品的流式孵育。 以這種方式，探針和靶序列之間的雜交過程的動(dòng)力學(xué)得到改善。 這顯著增強(qiáng)了信號強(qiáng)度。 此外，該方法提高了再現(xiàn)性并減少了勞動(dòng)時(shí)間。 該方法已針對 HER2、KMT2A（賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 2A）等基因進(jìn)行了測試。 接收CTC的方式似乎是微流控平臺的賊大挑戰(zhàn)。