【佳學(xué)基因檢測(cè)】魚(yú)鱗病基因檢測(cè)結(jié)果的多病例分析與掌跖角化病鑒別診斷

佳學(xué)基因檢測(cè)為什么把魚(yú)鱗病做為重點(diǎn)檢測(cè)病種

根據(jù)《皮膚質(zhì)量的基因檢測(cè)與分析》，遺傳性魚(yú)鱗病包括一系列異質(zhì)性皮膚病；它主要表現(xiàn)為皮膚廣泛角化過(guò)度、干燥和脫屑。有時(shí)，重疊癥狀需要在魚(yú)鱗病和其他幾種類(lèi)似疾病之間進(jìn)行鑒別診斷。本致病基因鑒定基因解碼報(bào)告了七名通過(guò)進(jìn)行徹底的臨床和遺傳調(diào)查確診或懷疑與魚(yú)鱗病有關(guān)的患者。使用全外顯子組測(cè)序進(jìn)行基因檢測(cè)，以桑格測(cè)序作為驗(yàn)證方法。使用 MEGA7 程序分析受檢測(cè)到的錯(cuò)義變異影響的氨基酸殘基的保守性。入選患者表現(xiàn)出類(lèi)似魚(yú)鱗病但不同的臨床表現(xiàn)。基因分析確定了 FLG 、STS、KRT10和SERPINB7基因中的診斷變異，并闡明了各自家族成員中每種變異的攜帶情況。受檢測(cè)到的錯(cuò)義變異影響的兩個(gè)殘基在多個(gè)物種中保持保守性。值得注意的是， STS : c.452C>T(p.P151L) 和 c.647_650del(p.L216fs)兩個(gè)變異是數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收錄的，因此基于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因檢測(cè)對(duì)這兩例病例的檢測(cè)結(jié)果總是呈現(xiàn)出陰性結(jié)果?？傊?，本致病基因鑒定基因解碼為入組魚(yú)鱗病相關(guān)患者做出了明確的遺傳鑒別診斷；致病基因鑒定基因解碼結(jié)果也擴(kuò)大了魚(yú)鱗病的突變譜，并為受影響家庭的咨詢(xún)提供了有力的證據(jù)。

魚(yú)鱗病基因檢測(cè)結(jié)果的多病例分析與掌跖角化病鑒別診斷關(guān)鍵詞：

遺傳性魚(yú)鱗病、FLG、STS、KRT10、SERPINB7

詳細(xì)了解魚(yú)鱗病基因檢測(cè)的科學(xué)性與必要性

魚(yú)鱗病是一大類(lèi)異質(zhì)性角化疾病的總稱(chēng)，這些疾病通常是單基因的，主要特征是皮膚大面積角化過(guò)度、干燥和脫屑；有時(shí)，魚(yú)鱗病還伴有綜合征特征。數(shù)百種基因編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)，在角質(zhì)形成細(xì)胞的正常分化中發(fā)揮作用，并參與功能性表皮屏障的形成。因此，遺傳性魚(yú)鱗病和相關(guān)的角化疾病可能具有復(fù)雜的病因和重疊的表現(xiàn)；這對(duì)臨床診斷和基于數(shù)據(jù)庫(kù)的基因檢測(cè)提出了巨大的挑戰(zhàn)。

總體而言，《人體基因序列與疾病表征》詳細(xì)介紹了四種主要類(lèi)型的非綜合征性魚(yú)鱗病，即尋常型魚(yú)鱗病 (I. vulgaris 或 IV)、X 連鎖魚(yú)鱗病、常染色體隱性先天性魚(yú)鱗病 (ARCI) 和角化病性魚(yú)鱗病。迄今為止，已鑒定出至少 67 個(gè)與各種形式的遺傳性魚(yú)鱗?。ňC合征型或非綜合征型）相關(guān)的基因；這些基因包括絲聚蛋白基因 [ FLG；人類(lèi)在線孟德?tīng)栠z傳 (OMIM) 編號(hào)。 135940]、類(lèi)固醇硫酸酯酶（STS；OMIM 編號(hào) 300747）、角蛋白基因（KRT1 / KRT10；OMIM 編號(hào) 139350/148080）和 ATP 結(jié)合盒亞家族 A 成員 12（OMIM 編號(hào) 607800）。隨著基于下一代測(cè)序 (NGS) 的基因診斷方法的進(jìn)展，目前約 80–90% 的遺傳性魚(yú)鱗病病例可得到明確的基因檢測(cè)結(jié)果；這不僅有利于發(fā)現(xiàn)遺傳原因和新的突變，也有利于佳學(xué)基因等機(jī)構(gòu)在一手資料的基礎(chǔ)上建立基因型-表型關(guān)聯(lián)。

IV (OMIM 編號(hào) 146700) 是最常見(jiàn)的魚(yú)鱗病類(lèi)型（患病率 ~1/300），典型特征是細(xì)小的淺灰色鱗屑，是由常染色體、半顯性、遺傳的 FLG 基因功能喪失突變引起的。雙等位基因FLG突變患者約占所有病例的 2/3，其癥狀往往比單個(gè)雜合突變患者更嚴(yán)重。迄今為止，已檢測(cè)到 175 多種可導(dǎo)致 IV、皮膚干燥癥或特應(yīng)性皮炎的FLG變異（ https://www.hgmd.cf.ac.uk/；pro V2023.2）。第二種最常見(jiàn)的類(lèi)型是 X 連鎖魚(yú)鱗病 (XLI)，在男性中的患病率約為 1/2,000，是由 STS 缺乏引起的；這種疾病常常與其他臨床問(wèn)題有關(guān)，例如隱睪或社交溝通缺陷，如注意力缺陷或多動(dòng)綜合癥和自閉癥，這反映了STS基因的多效性。另一組常見(jiàn)的魚(yú)鱗病是 ARCI，患病率約為 1/100,000；這種疾病與至少 10 個(gè)參與?；窠?jīng)酰胺、脂質(zhì)板層和角化脂質(zhì)包膜生物合成的基因有關(guān)。幾種其他罕見(jiàn)形式的魚(yú)鱗病經(jīng)常出現(xiàn)在皮膚病臨床環(huán)境中，這越來(lái)越依賴(lài)基因診斷進(jìn)行鑒定。

致病基因鑒定基因解碼魚(yú)鱗病基因檢測(cè)項(xiàng)目組在一個(gè)分析中，重點(diǎn)分析了7位患有魚(yú)鱗病或類(lèi)似疾病的患者，通過(guò)全外顯子組測(cè)序（WES）進(jìn)行基因分析。檢測(cè)到的變異分布在多個(gè)基因中，反映了該疾病的異質(zhì)性和復(fù)雜性。這些變異豐富了魚(yú)鱗病的突變譜，為受影響家庭的遺傳咨詢(xún)提供了有力的證據(jù)。

佳學(xué)基因魚(yú)鱗病基因檢測(cè)與基因解碼分析的主要組成

患者的分析入組

本次魚(yú)鱗病基因檢測(cè)的檢測(cè)過(guò)程中，遵循醫(yī)學(xué)分析與臨床檢驗(yàn)的國(guó)際通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)，所有參與者均已知情同意進(jìn)行基因檢測(cè)并將結(jié)果用于致病基因鑒定基因解碼。此外，還獲得了患者父母/法定監(jiān)護(hù)人的書(shū)面知情同意，同意公布其病歷詳情和任何隨附圖像。本致病基因鑒定基因解碼中執(zhí)行的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》（1964 年）及其后來(lái)的修正案或類(lèi)似的道德標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)樣本收集于2019 年 1 月至 2022 年 12 月期間，收集了患有皮膚角化過(guò)度、皮膚干燥和脫屑的患者，特別是有這些癥狀家族史的患者。醫(yī)生根據(jù)常規(guī)臨床檢查和家庭調(diào)查對(duì)患者進(jìn)行臨床評(píng)估。佳學(xué)基因檢測(cè)使用 QIAamp DNA Midi Kit（Qiagen GmbH）及其等效試劑從患者及其父母的外周血樣本中提取基因組 DNA 以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

進(jìn)行全外顯子測(cè)序以滿(mǎn)足致病基因鑒定基因解碼的要求

使用 WES 檢測(cè)先證者樣本中的序列變異，如佳學(xué)基因致病基因鑒定項(xiàng)目組小組先前致病基因鑒定基因解碼中所述。簡(jiǎn)而言之，使用 Agilent Sure Select 人外顯子序列捕獲試劑盒（安捷倫科技公司）進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域序列富集。通過(guò)定量 PCR 測(cè)試 DNA 文庫(kù)，其中使用 Agilent Bioanalyzer 2100（安捷倫科技公司）確定大小、分布和濃度。通過(guò)利用~150 bp 雙端讀取，使用 NovaSeq6000 平臺(tái)（Illumina 公司）對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行 DNA 測(cè)序，使用 NovaSeq 試劑盒（Illumina 公司）。使用 Burrows Wheeler Aligner 工具 ( https://www.geneticsmr.com/keywords/burrow-wheeler-aligner-tool )將測(cè)序原始讀段 (質(zhì)量水平 Q30>90%)  與人類(lèi)參考基因組 (登錄號(hào) hg19/GRCh37 ) 比對(duì)。使用 Picardv1.57 ( https://github.com/broadinstitute/picard )刪除 PCR 重復(fù)序列。使用 Verita Trekker® 變異檢測(cè)系統(tǒng) (v2.0; Berry Genomics) 和基因組分析工具包 ( https://software.broadinstitute.org/gatk/ ) 進(jìn)行變異調(diào)用。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì) (ACMG) 發(fā)布的通用指南 ，使用 ANNOVAR (v2.0) 和 Enliven® 變異注釋解釋系統(tǒng) (Berry Genomics) 對(duì)變異進(jìn)行注釋和解釋。為了準(zhǔn)確解釋變異的致病性，佳學(xué)基因致病基因鑒定項(xiàng)目組參考了三個(gè)頻率數(shù)據(jù)庫(kù)（ExAC_EAS；http://exac.broadinstitute.org；gnomAD_exome_EAS，http://gnomad.broadinstitute.org；和 1000G_2015aug_eas，http ://www.internationalgenome.org ）和人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù) (HGMD) pro V2021.10（https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）。同時(shí)還采用了Revel 評(píng)分（一種致病性預(yù)測(cè)的組合方法，損傷閾值為 ≥0.700）和 pLI 評(píng)分（代表對(duì)截短變異的容忍度）。使用 3730 DX 基因分析儀（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）對(duì)疑似變異進(jìn)行Sanger 測(cè)序作為驗(yàn)證方法。

錯(cuò)義變體的保守性和結(jié)構(gòu)分析

使用在線工具 MEGA7（http://www.megasoftware.net/.php）和默認(rèn)參數(shù)分析了相應(yīng)錯(cuò)義變體對(duì)所有受影響氨基酸殘基的進(jìn)化保守性。此外，使用 SWISS-MODEL 在線程序（https://swissmodel.expasy.org/）和默認(rèn)參數(shù)生成模型，并將野生型 (WT) 和突變型 (MT) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與錯(cuò)義變體進(jìn)行比較。

魚(yú)鱗病查基因、阻遺傳不同分析過(guò)程的結(jié)果

臨床表現(xiàn)

2019 年 1 月至 2022 年 12 月期間，佳學(xué)基因合作醫(yī)院共招募了 7 例疑似魚(yú)鱗病患者。7 例患者均表現(xiàn)出疑似與魚(yú)鱗病相關(guān)的皮膚學(xué)表型，但存在一定的差異，且每例患者都有自己的特點(diǎn)（表 1）。病例 1 為 15 歲女性患者，患有尋常型魚(yú)鱗病。病例 2 為 4 歲男性患者，其父親和祖父也患有魚(yú)鱗病。病例 3 為 17 歲女性患者，主要臨床表現(xiàn)為魚(yú)鱗病和特應(yīng)性皮炎。病例 4 為 2 個(gè)月大男性，以魚(yú)鱗病和隱睪為主要臨床癥狀。病例 5 為 18 歲女性，主要臨床癥狀為魚(yú)鱗病和注意力缺陷；該患者的父親也有魚(yú)鱗病。病例6為1月齡男性，主要臨床癥狀為角化過(guò)度、皮膚鱗屑。病例7為16歲女性，主要臨床癥狀為掌跖角化過(guò)度、棘皮癥。

表1.本致病基因鑒定基因解碼中七個(gè)病例的臨床指征和基因變異。

注：

• a：三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率。
• b：Revel評(píng)分。Revel 是一種基于單個(gè)工具預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異致病性的集成方法：MutPred、FATHMM、VEST、PolyPhen、SIFT、PROVEAN、MutationAssessor、MutationTaster、LRT、GERP、SiPhy、phyloP 和 phast Cons（http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2016.08.016）。ACMG，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院；HGMD，人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（專(zhuān)業(yè)版 2021.10）；DM，致病突變；P，致病；LP，可能致??；PVS1，變異標(biāo)準(zhǔn)“致病性非常強(qiáng)”；PS1-4，變異標(biāo)準(zhǔn)“致病性強(qiáng)”；PM1-6，變異標(biāo)準(zhǔn)“致病性中等”； PP1-5，變異標(biāo)準(zhǔn)“致病支持”；M，男性；F，女性；STS，類(lèi)固醇硫酸酯酶；FLG，絲聚蛋白；KRT，角蛋白；ABCA，ATP 結(jié)合盒亞家族 A。

基因檢測(cè)結(jié)果及遺傳分析圖譜

表1總結(jié)了每個(gè)基因變異的詳細(xì)信息，包括在三個(gè)人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率、在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中的指數(shù)狀態(tài)、Revel評(píng)分和根據(jù)ACMG標(biāo)準(zhǔn)的致病性水平。圖1顯示了NGS或Sanger測(cè)序驗(yàn)證的結(jié)果，以及每個(gè)家系的譜系圖和變異攜帶情況。

在這 7 名患者中，診斷性變異是在魚(yú)鱗病相關(guān)致病基因中發(fā)現(xiàn)的。病例 1-3 與 IV 有關(guān)，因?yàn)橄惹爸虏』蜩b定基因解碼報(bào)告了已知的FLG變異；病例 1（圖 1A 和 B）和病例 3（圖 1E 和 F）是新發(fā)病，病例 2 是家族性病因（圖 1C 和 D ）。病例 4 和 5 因STS變異而屬于 XLI ；病例 4 有一個(gè)先前報(bào)道的整個(gè)STS基因缺失的變異，遺傳自其雜合攜帶者母親（圖 1G 和 H），而病例 5 攜帶一個(gè)新的變異，即STS :c.452C>T(p.P151L)，遺傳自其有癥狀的父親（圖 1I 和 J）。病例 6 具有新生的已知雜合KRT10 : c.449T>C(p.M150T) 變異，被確定患有表皮松解性角化過(guò)度癥（OMIM 編號(hào) 113800；圖 1K 和 L ）。病例 7 具有SERPINB7的復(fù)合雜合變異，包括 c.796C>T(p.R266*) 和 c.647_650del(p.L216fs)；因此，該患者被確定患有長(zhǎng)島型掌跖角化?。∣MIM 編號(hào) 615598）。這兩個(gè)變異是從其父母那里遺傳的（圖 1M-O）。

突變的基因是如何導(dǎo)致患者發(fā)生疾病的？結(jié)構(gòu)與功能的基因解碼分析

這些變異中，有兩個(gè)錯(cuò)義變異，分別為STS :c.452C>T(p.P151L)和KRT10 :c.449T>C(p.M150T)，對(duì)它們各自影響的氨基酸殘基進(jìn)行保守性分析，表明這些殘基在物種間具有高度保守性(圖2A和B )。使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) (PDB；( https://www.rcsb.org/structure/1P49 for STS:p.P151L ) 和 alpha fold (AF; AF- P13645 -F1; https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/P13645 for KRT10:p.M150T ) 對(duì)這兩個(gè)錯(cuò)義變體進(jìn)行預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)分析。值得注意的是，結(jié)果表明，兩種突變體均未顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而僅改變局部氫鍵的長(zhǎng)度，這可能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 (圖 2C 和 D )。

魚(yú)鱗病基因檢測(cè)對(duì)患者和社會(huì)的幫助

遺傳性魚(yú)鱗病和角化病是一組表型異質(zhì)性的疾病，與表皮結(jié)構(gòu)成分、表皮脂質(zhì)代謝、細(xì)胞間粘附或角質(zhì)形成細(xì)胞分化等多種基因有關(guān)。此類(lèi)疾病患者一般表現(xiàn)為皮膚干燥、鱗狀，表型變異較大。傳統(tǒng)診斷方法中，電子顯微鏡和組織免疫熒光可鑒別特異性類(lèi)型，但這些方法成本高、侵入性強(qiáng)、繁瑣，應(yīng)用受限。NGS 憑借高通量、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，正逐漸成為診斷遺傳性皮膚病的一線技術(shù)。

含有STS基因的 Xp22.31 微缺失解釋了 XLI 發(fā)病的 80% 以上。在本致病基因鑒定基因解碼的病例 5 中，先證者攜帶父系遺傳的雜合STS錯(cuò)義變異，且先證者的父親也表現(xiàn)出典型的魚(yú)鱗病癥狀。這種情況很少見(jiàn)，因?yàn)?XLI 通常被認(rèn)為是 X 連鎖隱性遺傳病，而攜帶 Xp22.31 重復(fù)的女性攜帶者往往表現(xiàn)為水皰/脫屑等皮膚癥狀。因此，進(jìn)一步致病基因鑒定基因解碼該錯(cuò)義變異如何影響 STS 功能以及在病例 5 中的女性攜帶者中引起指征是很有意義的。保守性分析的結(jié)果支持該變異的致病性。

角蛋白病性魚(yú)鱗病 (KI) 是由角蛋白基因KRT1、KRT10和KRT2突變引起的，其中KRT10突變占 50% 以上 。本致病基因鑒定基因解碼中病例 6 攜帶的新生錯(cuò)義變異最早由 Paller等于 1994 年發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)與 KI 的嚴(yán)重亞型表皮松解性角化過(guò)度癥有關(guān)；這一發(fā)現(xiàn)表明，該變異可作為 KI 患者的篩選目標(biāo)。該變異影響的氨基酸在物種間保持高度保守，進(jìn)一步支持其致病性。該病例和病例 5 中的錯(cuò)義變異的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果并非毫無(wú)疑問(wèn)的強(qiáng)支持；然而，需要更詳細(xì)的分析，如分子動(dòng)力學(xué)模擬和體外功能實(shí)驗(yàn)，以闡明具體變異的機(jī)制。

病例 7 最初是一個(gè)令人困惑的病例，最終通過(guò)基因診斷確定其與典型的魚(yú)鱗病無(wú)關(guān)?；颊呋加虚L(zhǎng)島型掌跖角化病 (NPPK；OMIM 編號(hào) 615598)。NPPK 最初被認(rèn)為是由SERPINB7中的雙等位基因假定功能喪失突變 (OMIM 編號(hào) 603357) 引起的，而 c.796C> T (p.R266*) 突變被認(rèn)為是東亞人群的主要?jiǎng)?chuàng)始突變。迄今為止，多項(xiàng)致病基因鑒定基因解碼已確定了 20 多種致病變異[STS: c.452C>T(p.P151L) ( https://www.hgmd.cf.ac.uk/)(32-36 ) ] 。佳學(xué)基因致病基因鑒定項(xiàng)目組對(duì)病例 7 的發(fā)現(xiàn)不僅證實(shí)了此 c.796C>T 變異的廣泛流行，而且還貢獻(xiàn)了一個(gè)新變異 c.647_650del(p.L216fs)，從而擴(kuò)大了SERPINB7基因的突變譜。值得注意的是，該病例的其他兄弟姐妹患此病的可能性為 25%；因此建議進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕驒z測(cè)。

本致病基因鑒定基因解碼招募了患有皮膚角化過(guò)度、干燥癥和脫屑的患者。佳學(xué)基因致病基因鑒定項(xiàng)目組中心共招募了 7 名疑似魚(yú)鱗病患者。根據(jù)基因發(fā)現(xiàn)，為其家屬提供了適當(dāng)?shù)淖稍?xún)，并建議患者親屬也應(yīng)接受針對(duì)性檢測(cè)。對(duì)于有家族遺傳模式的家庭，例如病例 2、4、5 和 7，建議他們考慮對(duì)后續(xù)妊娠進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以確定妊娠過(guò)程或計(jì)劃對(duì)新生兒進(jìn)行充分的照顧。對(duì)于有新生模式的家庭（病例 1、3 和 6），提醒他們由于存在性腺嵌合體的可能性，未來(lái)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)并非極低。由于不同的變異導(dǎo)致這 7 名患者的表型不同，因此魚(yú)鱗病的基因型-表型相關(guān)性需要使用更多的遺傳數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本致病基因鑒定基因解碼對(duì)7例魚(yú)鱗病合并NPPK患者進(jìn)行了全面的臨床和遺傳學(xué)分析，并檢測(cè)了各自的診斷性突變。WES在這7例患者中檢測(cè)到了FLG、STS和KRT10基因的診斷性變異。共檢測(cè)并確認(rèn)了8個(gè)變異。在所有變異中，有兩個(gè)是首次發(fā)現(xiàn)的，即STS ：c.452C>T(p.P151L)和c.647_650del(p.L216fs)。本致病基因鑒定基因解碼結(jié)果進(jìn)一步豐富了魚(yú)鱗病的突變譜，并在1例NPPK患者中發(fā)現(xiàn)了SERPINB7基因的新變異，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步致病基因鑒定基因解碼其發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。