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【佳學(xué)基因檢測(cè)】第三代測(cè)序是高通量測(cè)序嗎?

【佳學(xué)基因】第三代測(cè)序是高通量測(cè)序嗎? 1.PacBio SMRT單分子測(cè)序技術(shù) Pacific Biosciences于2004年成立,2010年納斯達(dá)克上市,2011年P(guān)acBioRS發(fā)布。 以PacBio測(cè)序?yàn)榇淼牡谌驕y(cè)序技術(shù)逐漸應(yīng)用到多個(gè)科研領(lǐng)域。該平臺(tái)利于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù),又稱作SMRT(Single Molecule Real-Time)測(cè)序,基于納米小孔的單分子讀取技術(shù),無(wú)需擴(kuò)增即可快速完成序列讀取。 建庫(kù) 因?yàn)闇y(cè)序讀長(zhǎng)很長(zhǎng),因此

佳學(xué)基因檢測(cè)】第三代測(cè)序是高通量測(cè)序嗎?

1.PacBio SMRT單分子測(cè)序技術(shù)

Pacific Biosciences于2004年成立,2010年納斯達(dá)克上市,2011年P(guān)acBioRS發(fā)布。

以PacBio測(cè)序?yàn)榇淼牡谌驕y(cè)序技術(shù)逐漸應(yīng)用到多個(gè)科研領(lǐng)域。該平臺(tái)利于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù),又稱作SMRT(Single Molecule Real-Time)測(cè)序,基于納米小孔的單分子讀取技術(shù),無(wú)需擴(kuò)增即可快速完成序列讀取。

建庫(kù)

因?yàn)闇y(cè)序讀長(zhǎng)很長(zhǎng),因此可以制備大片段(3-10kb)文庫(kù);不同于其他二代測(cè)序文庫(kù),該文庫(kù)兩端分別連接環(huán)狀單鏈,單鏈兩端又與雙鏈正負(fù)鏈連接,得到類似啞鈴的結(jié)構(gòu),稱為SMRT Bell。

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測(cè)序

SMRT Cell芯片含有數(shù)百萬(wàn)個(gè)納米級(jí)的零模波導(dǎo)孔(zero-mode wave guides, ZMWs),ZMW是一個(gè)直徑只有10~50nm的孔,引物在模板的單鏈環(huán)部位退火后,這個(gè)雙鏈部位就可以結(jié)合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。

每個(gè)ZMW都能夠包含一個(gè)DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進(jìn)行單分子測(cè)序,4種dNTP帶有不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)激光打在ZMW底部時(shí),只能照亮很小的區(qū)域,DNA聚合酶就被固定在這個(gè)區(qū)域。

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只有在這個(gè)區(qū)域內(nèi),堿基攜帶的熒光基團(tuán)被激活從而被檢測(cè)到。當(dāng)DNA合成進(jìn)行時(shí),下一個(gè)堿基進(jìn)行延伸,上一個(gè)dNTP上的熒光基團(tuán)就會(huì)被切除,高效了檢測(cè)的連續(xù)性。

不同的堿基會(huì)發(fā)出不同的光,此時(shí)根據(jù)光的波長(zhǎng)及峰值便可判斷堿基類型。

2.納米孔測(cè)序技術(shù)

2005年,牛津納米孔科技有限公司(Oxford Nanopore Technologies)成立,致力于納米孔測(cè)序技術(shù)的商業(yè)轉(zhuǎn)化。2014年Nano space單分子測(cè)序技術(shù)發(fā)布。

牛津納米孔公司開(kāi)發(fā)的納米單分子測(cè)序技術(shù)與以往的測(cè)序技術(shù)皆不同,它是基于電信號(hào)而不是光信號(hào)。

納米孔測(cè)序技術(shù)的核心是一種整合了多個(gè)跨膜通道蛋白(即納米孔蛋白)的多聚物膜。通過(guò)在膜兩側(cè)施加電壓從而產(chǎn)生穩(wěn)定的穿過(guò)納米孔的電流。當(dāng)有其他物體穿過(guò)納米孔時(shí),會(huì)影響電流的大小,從而產(chǎn)生可識(shí)別的電信號(hào)的變化。

測(cè)序時(shí),DNA雙鏈在馬達(dá)蛋白的牽引下解螺旋為單鏈DNA,并穿過(guò)納米孔蛋白(也叫Reader蛋白)。由于ATCG四種堿基結(jié)構(gòu)和大小的差異,會(huì)使電流產(chǎn)生特征性離子電流變化,通過(guò)識(shí)別這種電信號(hào)的變化,從而達(dá)到讀取堿基序列的目的。

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不同型號(hào)的納米孔測(cè)序儀原理非常一致,其核心均為納米孔測(cè)序芯片。常規(guī)的納米孔測(cè)序芯片整合512個(gè)測(cè)序通道,每個(gè)測(cè)序通道包含四個(gè)納米孔,官方數(shù)據(jù)顯示單張芯片不間斷測(cè)序48h,可產(chǎn)生20-30G的數(shù)據(jù)量。

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二代測(cè)序的出現(xiàn)極大地解決了通量問(wèn)題,在大幅提高測(cè)序速度和正確性的同時(shí)大大降低了測(cè)序成本,但閱讀長(zhǎng)度相對(duì)較短。而以單分子測(cè)序?yàn)橹饕卣鞯娜鷾y(cè)序,正朝著單分子、長(zhǎng)讀長(zhǎng)、低成本、小型化的方向發(fā)展,實(shí)現(xiàn)了測(cè)序領(lǐng)域的又一次變革。

 

 

(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)
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