【佳學(xué)基因檢測】圓頭精子癥的臨床表現(xiàn)及基因檢測

圓頭精子癥（Globozoospermia）是一種罕見的男性不育癥，主要特征是精子頭部呈球形，缺乏正常的橢圓形或尖形。圓頭精子癥會導(dǎo)致精子功能的嚴(yán)重障礙，進(jìn)而影響生育能力。以下是該病的不同名稱和臨床表現(xiàn)。

不同名稱：

1. 圓頭精子癥（Globozoospermia）：最常用的名稱，指的是精子頭部呈球形或接近球形，嚴(yán)重影響精子的正常功能。
2. 精子球形癥：有時也稱為精子球形癥，強(qiáng)調(diào)精子頭部為球形的特征。
3. 球形精子癥：有些文獻(xiàn)中也稱為球形精子癥，意指精子的頭部失去正常形態(tài)，變?yōu)閳A球狀。
4. 無頂體精子癥：有些情況下，圓頭精子癥會伴隨精子缺乏頂體（Acrosome），這可能被稱為無頂體精子癥。

臨床表現(xiàn)：

1. 不育癥：

   • 圓頭精子癥最明顯的臨床表現(xiàn)是男性不育癥。精子由于頭部形態(tài)異常，失去了正常的頂體（acrosome），這使得精子無法正常與卵細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致受精障礙。
   • 這種疾病通常與嚴(yán)重的精子形態(tài)異常有關(guān)，即使精子數(shù)量正常，也無法完成受精過程。

2. 精子形態(tài)異常：

   • 在精液分析中，圓頭精子癥的精子大多呈球形頭部，缺乏正常的精子頭部結(jié)構(gòu)。精子頭部的形態(tài)異常直接影響其穿透卵細(xì)胞的能力。
   • 精子在顯微鏡下呈現(xiàn)為圓形或近乎圓形的頭部，沒有正常的橢圓形或尖頭。

3. 其他精液異常：

   • 除了頭部形態(tài)異常外，患者的精液中可能還會有精子數(shù)量減少或精子活力差等問題，進(jìn)一步影響生育能力。
   • 也有部分患者可能伴隨有精子尾部發(fā)育不良、精子運(yùn)動性差等癥狀。

4. 遺傳因素：

   • 圓頭精子癥通常是由遺傳性因素引起的，尤其與染色體異?；蛱囟ɑ蛲蛔儯ㄈ缗c頂體形成相關(guān)的基因突變）有關(guān)。大多數(shù)病例為常染色體隱性遺傳。

5. 生育困難：

   • 由于精子無法正常受精，圓頭精子癥患者通常面臨較大的生育困難，尤其是不能自然懷孕。

診斷方法：

1. 精液分析：通過顯微鏡觀察精子形態(tài)，診斷是否存在大量球形或異常的精子。通常通過精子形態(tài)學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)精子頭部完全呈球形或接近球形，缺乏正常的頂體。
2. 基因檢測：為確診是否由遺傳性因素引起，通常建議進(jìn)行基因檢測，特別是檢測與頂體發(fā)育相關(guān)的基因變異。
3. 超聲檢查：在一些病例中，超聲檢查可以用于排除與睪丸或生殖系統(tǒng)其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的潛在異常。

治療方法：

1. 輔助生殖技術(shù)：

   • 由于精子的形態(tài)異常，圓頭精子癥的患者通常無法通過自然受孕懷孕。最常用的治療方式是單精子注射技術(shù)（ICSI），將一枚精子直接注射到卵細(xì)胞中，從而繞過精子頭部的缺陷進(jìn)行受精。
   • 體外受精（IVF）結(jié)合ICSI技術(shù)是治療圓頭精子癥常見的方案。

2. 遺傳咨詢：

   • 由于圓頭精子癥可能具有遺傳性，進(jìn)行遺傳咨詢是必要的，以評估遺傳模式和對后代的潛在影響。
   • 對于有家族史的患者，遺傳檢測可以幫助評估是否有遺傳風(fēng)險，并為患者提供相關(guān)的生育建議。

3. 其他輔助治療：

   • 雖然圓頭精子癥患者的精子存在形態(tài)問題，但有時仍會嘗試采取一些藥物或激素治療，以提高精子的質(zhì)量或數(shù)量，但效果相對較差。

總的來說，圓頭精子癥（Globozoospermia）是一種影響男性生育能力的嚴(yán)重疾病，主要通過精子形態(tài)異常來表現(xiàn)。盡管其影響生育，但現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)為患者提供了希望，通過體外受精和單精子注射技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)受孕。
 

圓頭精子癥精液采集和分析

在禁欲 4 天后采集精液。將樣本儲存在 37℃ 的溫度下，直到凝塊液化。由一位經(jīng)驗(yàn)豐富且訓(xùn)練有素的精液分析生物學(xué)家對樣本進(jìn)行分析。精液分析根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2010 年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。簡而言之，不斷評估樣本的液化程度，直到達(dá)到液化程度。液化后，對精液的外觀、體積和 PH 值進(jìn)行評估。在宏觀評估結(jié)束時，將樣本徹底混合，取 10 μL 樣本在 10 倍放大鏡下評估是否存在粘液絲、圓形細(xì)胞以及精子凝集或聚集區(qū)域。在采集后 60 分鐘內(nèi)，在 20 倍放大鏡下，對若干個 10 μL 充分混合的精液樣本進(jìn)行精子活力評估。最終值由計數(shù)的不同速率的平均值給出。采用Neubauer小室測定精子濃度，制備精液涂片、染色，在40倍放大鏡下觀察，根據(jù)嚴(yán)格的Kruger標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估。
 

圓頭精子癥流式細(xì)胞分析

流式細(xì)胞術(shù)用于分析以下生物功能精子參數(shù)：染色質(zhì)致密性、凋亡/存活精子百分比、線粒體膜電位 (MMP)、DNA 碎片化。所有分析均使用流式細(xì)胞儀 CytoFLEX（Beckman Coulter，IL，米蘭，意大利）進(jìn)行，該儀器配備兩個氬激光器和六個熒光通道（四個 488 nm 和兩個 638 nm），每個樣本測量 100,000 個事件，并通過軟件 CytExpert 1.2 進(jìn)行分析。

具體而言，染色質(zhì)致密性評估是在細(xì)胞膜透化以使熒光團(tuán)滲透到細(xì)胞核后進(jìn)行的。將 1×10 6 /mL 精子等分試樣與 LPR DNA-Prep 試劑 (Beckman Coulter, IL) 在室溫下避光孵育 10 分鐘，然后在室溫下進(jìn)一步與含有 50 µg/mL 碘化丙啶 (PI) (<0.5%)、RNase A (4 KUnitz/mL)、<0.1% NaN 3、生理鹽水和穩(wěn)定劑 (Beckman Coulter, IL) 的 Stain DNA-Prep 試劑一起孵育。30 分鐘后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

通過將精子與 PI 和用異硫氰酸熒光素 (FITC) 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白 V 同時孵育，評估存活精子和晚期或早期凋亡精子的百分比。

將含有 0.5×10 6 /mL的等分試樣懸浮在含有 10 µL 膜聯(lián)蛋白 V-FITC 和 20 µL PI（膜聯(lián)蛋白 V-FITC 凋亡；意大利米蘭 Beckman Coulter IL）的 0.5 mL 緩沖液中，并在黑暗中孵育 10 分鐘。孵育后，立即分析樣品。不同的染色模式使我們能夠識別出 3 種不同的細(xì)胞群：活細(xì)胞（FITC 陰性和 PI 陰性）；細(xì)胞質(zhì)膜仍完整的早期凋亡細(xì)胞（FITC 陽性和 PI 陰性）；晚期凋亡細(xì)胞（FITC 陽性和 PI 陽性）。

通過能夠滲透到線粒體的親脂性探針 5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′四乙基-苯并咪唑基羰花青碘 (JC-1；DBA Srl，意大利米蘭) 來評估 MMP。簡而言之，將含有 1×10 6 /mL 精子的等分試樣在 37℃ 的黑暗條件下與 JC-1 一起孵育 10 分鐘。孵育結(jié)束時，用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 清洗細(xì)胞并進(jìn)行分析。因此，當(dāng)線粒體膜變得更加極化時，熒光會可逆地從綠色變?yōu)槌壬?。在具有正常膜電位的活?xì)胞中，JC-1 以聚集體的形式存在于線粒體膜中，發(fā)出橙色熒光，而在具有低膜電位的細(xì)胞中，它以單體形式保留在細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。

使用 Apoptosis Mebstain (DBA Srl) 試劑盒，通過 TUNEL 檢測法評估 DNA 碎片，該試劑盒使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT)，該酶可在 DNA 斷裂水平上聚合與熒光染料結(jié)合的修飾核苷酸。為了獲得陰性對照，從反應(yīng)混合物中省略了 TdT；陽性對照是在染色前用 1 mg/mL 脫氧核糖核酸酶 I（不含 RNAse）在 37℃ 下預(yù)處理精子（約 0.5×10 6 /mL）60 分鐘。
 

圓頭精子癥基因分析

為了評估畸形精子癥的遺傳病因，要求患者提供血液樣本進(jìn)行基因檢測。使用商業(yè)試劑盒（Samag 血液 DNA 提取試劑盒；Sacace Biotechnologies Srl，意大利科莫）從外周血中提取 DNA，并在 MiSeqIllumina 儀器上用專為畸形精子癥設(shè)計的定制基因組進(jìn)行 NGS 分析。通過 Illumina Nextera 快速捕獲富集試劑盒（Illumina，美國加利福尼亞州圣地亞哥）富集目標(biāo)區(qū)域。該面板由以下基因組成：DPY19L2（OMIM：613893）、SPATA16（OMIM：609856）、PICK1（OMIM：605926）和ZPBP（OMIM：608498）。這些序列被映射到人類參考序列 GRCh28 上。在人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD professional； http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）和MASTERMIND（https://www.genomenon.com/mastermind/ ）中搜索致病變異。使用Sanger測序確認(rèn)NGS變異，并研究家庭成員中的變異分離。
 

圓頭精子癥基因突變分析

變異按如下方式過濾：1) 考慮 1,000 Genomes ( http://www.1000genomes.org/home )、EVS ( https://evs.gs.washington.edu/EVS/ ) 和 GNOMAD ( https://gnomad.broadinstitute.org/ ) 數(shù)據(jù)庫中次要等位基因頻率 (MAF) 小于 1% 的變異；2) 評估重點(diǎn)是沿側(cè)翼 ±15 內(nèi)含子堿基的編碼外顯子；3) 對于 GMAF/MAX MAF 低于已知疾病頻率的同義和剪接變異，已在數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證其存在，例如 HGMD。變異的解釋由美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院 (ACMG) 指南評分系統(tǒng)提供。除良性或可能是良性的變異外，所有與患者表型相關(guān)的變異均會報告。突出顯示的變異被分為致病性、可能致病性和意義不明。生物信息學(xué)工具用于計算機(jī)預(yù)測致病性（例如 SIFT、MutationTaster、PROVEAN、Polyphen2）并評估錯義變異的進(jìn)化保守性。